豬瘟（ＣＳＦ）是一種急性熱性傳染病，是zui常見的重要豬病之一。對豬瘟的成功控制主要依賴于疫苗免疫，因此，疫苗免疫效果的優(yōu)劣對豬瘟防控起了決定性作用。豬瘟抗體水平的檢測是疫苗免疫
效果評價的主要方法。本課題組建立了豬瘟抗體間接ＥＬＩＳＡ檢測方法，并將其組裝成試劑盒，對試劑盒的批間、批內(nèi)穩(wěn)定性和保存期等進行了研究。
一、材料與方法
1)豬瘟抗體間接ＥＬＩＳＡ（簡稱Ｉ－ＥＬＩＳＡ，下同）試劑盒，由上海恒遠生物科技有限公司獨立實驗室研制，批號為２０１5０3０５、２０１5０4０７、２０１505０９；豬瘟抗體阻斷ＥＬＩＳＡ（簡稱Ｂ－ＥＬＩＳＡ，下同）試劑盒，豬瘟陽性血清１６份和陰性血清９份，豬瘟活疫苗（傳代細胞源）。
2)批內(nèi)穩(wěn)定性試驗:隨機抽取同一批次試劑盒中的３件，按照說明書對１６份陽性血清和９份陰性血清血清樣本進行檢測，比較試劑盒的變異系數(shù)。
3)批間穩(wěn)定性試驗:從３個不同批次試劑盒中隨機抽?。奔?，按照說明書對上述１６份陽性血清和９份陰性血清樣本進行檢測，比較試劑盒的變異系數(shù)。
4)保存期試驗:隨機抽?。保布噭┖兄糜冢病妗浮姝h(huán)境中，每隔１個月取出１件對經(jīng)２倍梯度稀釋的標準陽性血清進行檢測，直至第9個月。比較不同梯度血清檢測結(jié)果的變化。
5)ＦＶＮＴ 的符合率:田間采集４７４份豬血清，用豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒和ＦＶ6)對疫苗免疫豬抗體增長趨勢的檢測:選?。奉^豬瘟抗體陰性仔豬，分為免疫組和對照組。免疫組５頭，免疫１頭份豬瘟活疫苗（傳代細胞源）；對照組２頭，接種生理鹽水。自免疫后的第１天開始，每隔３ｄ對兩組動物進行前腔靜脈采血，直至第２１__天。２１ｄ后定期采血，直至免疫后的第２１３天。分別用豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ 試劑盒和豬瘟抗體Ｂ－ＥＬＩＳＡ試劑盒進行檢測。
二、結(jié)果
1）批內(nèi)穩(wěn)定性試驗：同一批試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)均小于１０％，因此說明，該試劑盒具有較好的批內(nèi)穩(wěn)定性。
2）批間穩(wěn)定性結(jié)果：不同批次反應板的變異系數(shù)zui高為１１％，仍在１５％的可接受范圍內(nèi)，說明該試劑盒具有很好的批間穩(wěn)定性。
3）保存期試驗：隨著保存期的延長，梯度稀釋的陽性血清ＩＥ值一直維持在一個穩(wěn)定的范圍內(nèi)，血清效價始終為１２８倍（ＩＥ值≥１０％）。
三、討論
1.豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒的穩(wěn)定性：ＥＬＩＳＡ試劑盒的穩(wěn)定性是試劑盒質(zhì)量的重要標準之一。在進行試劑盒生產(chǎn)時，應嚴格按照已經(jīng)優(yōu)化的試驗條件進行，保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一性。
2.試劑盒的保存期：保存期是試劑盒質(zhì)量的另一個重要指標。影響保存期的因素很多，酶標板的熱穩(wěn)定性，酶標二抗、對照血清以及稀釋液等均會對zui終的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，在進行試劑盒研發(fā)時應充分考慮上述因素。本試劑盒通過保存期試驗證明，在４℃～８℃下保存9個月，不會影響試劑盒的檢測結(jié)果。為了充分保證試劑盒的有效性，將保存期縮短３個月，即確定試劑盒zui終的保存期為6個月。
3.與ＦＶＮＴ的符合率：雖然豬瘟的診斷方法很多，但是各種技術(shù)均存在不同程度的優(yōu)缺點，各方法之間的相關(guān)性研究較少。ＦＶＮＴ 作為檢測豬瘟病毒中和抗體的經(jīng)典方法，是貿(mào)易的豬瘟抗體檢測方法。中和作用是特異性結(jié)合，抗體附著在游離抗原表面，阻止其吸附敏感細胞上，進而阻止穿入細胞復制。因此，中和試驗是zui直接反應血清抗病毒效果的方法。根據(jù)上述結(jié)果，Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒與ＦＶＮＴ的符合率可達９２％，在基層大規(guī)模普查過程中，能夠反映中和抗體水平，為免疫程序的制定和抗體水平的監(jiān)測提供可靠的數(shù)4）對免疫豬血清抗體的動態(tài)監(jiān)測：通過對免疫豬抗體增長趨勢的檢測結(jié)果看出，豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ對抗體由陰轉(zhuǎn)陽的檢出時間為免疫后的１２～１５ｄ，而Ｂ－ＥＬＩＳＡ試劑盒檢測表明在免疫后的１５～２８ｄ陸續(xù)由陰性轉(zhuǎn)為陽性。由于Ｉ－ＥＬＩＳＡ 檢測的是針對Ｅ２蛋白的所有抗體，而Ｂ－ＥＬＩＳＡ檢測的是針對Ｅ２蛋白某一個表位的抗體，在免疫初期由于抗體豐度的不同，導致Ｉ－ＥＬＩＳＡ對陽性抗體的檢出要早于Ｂ－ＥＬＩＳＡ。另外，從兩種試劑盒檢測抗體增長趨勢圖中可以看出，豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒可以對不同抗體水平的豬血清進行有效的區(qū)分，可以從ＩＥ值上直觀的比較兩份血清抗體水平的高低。該試劑盒中所采用的標準陽性血清為反復免疫的豬瘟抗體強陽性血清，而待檢的免疫血清在免疫后２１３ｄ達到zui高值時，仍不到陽性對照血清ＯＤ值的８０％。因此說明，Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒能夠在更寬的范圍內(nèi)對抗體水平進行區(qū)分。而Ｂ－ＥＬＩＳＡ試劑盒采用的是阻斷ＥＬＩＳＡ原理，當抗體達到可以將包被的抗原全部封閉的水平后，就出現(xiàn)了檢測平臺期。因此，阻斷ＥＬＩＳＡ只能在一定范圍內(nèi)對抗體水平的高低進行區(qū)分。因此，可根據(jù)種群和生產(chǎn)需要等情況選擇不同的檢測方法。